免疫組織化學或者免疫細胞化學，是基于抗原-抗體相互識別作用，在光學顯微鏡的水平上利用抗體特異性結合，對組織或細胞內的特異性抗原進行定位的一種方法。目前該方法被廣泛地應用于病理診斷及科研實驗當中。小編這次和大家聊一聊當年自己在科研生涯中踩過哪些免疫組化的坑？

一般來說，組織需經過固定、脫水、包埋之后再進行免疫組化染色，其中固定是踩坑的要任務，目前常用的交聯固定劑一般為甲醛類，但是不排除某些特定組織有特殊固定液（如昆蟲等）。如果組織固定不充分，極易造成抗原的聚集、彌散或者異位。小編就遇到過一次抗原異位，整張片子上分不出來哪里是陽性，像這樣。

邁過一個，緊接著我們來聊聊第二個坑，抗原修復。目前廣泛應用的是熱修復和蛋白酶K修復，前者是利用加熱將醛基交聯的蛋白質共價鍵打開，使得抗原表位暴露出來，后者是利用蛋白消化方法打開的交聯鍵，常用于容易脫片的組織。熱修復常用的兩種不同的抗原修復液：檸檬酸鈉pH 6.0和EDTA pH 8.0，兩種修復液的pH不同，導致后抗原暴露后恢復的構象可能會有所差異。說到這里，大家可能很困惑，究竟要怎樣選擇抗原修復液呢？小編推薦給大家一條捷徑立即聯系購買抗體的制造商，如果實在無法獲得相關信息建議從用檸檬酸鈉pH6.0開始嘗試。

如果說運氣足夠好，能夠成功跳過前兩個坑，第三個坑是一個隱藏的難點：一抗的孵育方式。大部分情況下，小編都會使用4度過夜的方式進行孵育，但是偶爾鬧點小情緒，想要盡快的結束實驗，也嘗試過37度孵育一小時，不得不說，這種方法不僅時間短，背景色還很高呢。關鍵的是，不是所有抗體都適用于37度孵育一小時，小編的實驗生涯滑鐵盧之一就是預實驗的時候進行4度過夜的方式進行孵育，效果很好，正式實驗使用37度孵育一小時之后發現，沒有染色，結果不僅是重做還要被師姐熊。

說了這么多，其實只是冰山一角，前期封閉內源性HRP，中間的血清封閉非特異性位點，后的DAB顯色鏡檢、蘇木素返藍都是事故多發地區。對于鮮少進行免疫組化實驗室來說，更是難上加難。

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