Cell Counting Kit-8

產(chǎn)品簡介：     Cell Counting Kit-8 簡稱CCK-8試劑盒，為MTT法的替代方法，是一種基于WST（水溶性四唑鹽，化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。可用于藥物篩選、細(xì)胞增殖測定、細(xì)胞毒性測定、腫瘤藥敏等試驗

使用說明：

一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（測定細(xì)胞具體數(shù)量時）

1、先用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞。 

2、按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細(xì)胞濃度梯度，一般要做3-5個細(xì)胞濃度梯度，每組3-6個復(fù)孔。

3、接種后培養(yǎng)細(xì)胞貼壁，然后加CCK-8試劑培養(yǎng)一定時間后測定OD 值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)（X 軸），OD 值為縱坐標(biāo)（Y 軸）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量（試用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提是實驗的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入CCK-8后的培養(yǎng)時間。）

二、細(xì)胞活性檢測

1、在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（在37℃,5% CO2的條件下）。 

2、向每孔加入10μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù)）。 

3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時。 

4、用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度。 

5、如果暫時不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCl或者1%SDS(W/V)溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

三、細(xì)胞增值-毒性檢測

1、在96孔板中配置100 μL 的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時（在37 ℃，5% CO2的條件下）。 

2、向培養(yǎng)板加入10μL不同濃度的待測物質(zhì)。在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r間（例如：6、12、24或48小時）。

3、向每孔加入10 μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù)）。如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。

4、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時。

5、用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。

6、如果暫時不測定OD 值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCl或者1%SDS(W/V)溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

活力計算：.

細(xì)胞活力（％）=[A(加藥)－A(空白)]／[ A(0加藥)－A(空白)]×100 

A（加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度 

A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度 

A（0 加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度 

細(xì)胞活力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力

注意事項： 

①建議先做幾個孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時間。 

②白細(xì)胞可能需要培養(yǎng)較長時間。 

③當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96 孔板時，貼壁細(xì)胞的小接種量少為1 ,000個/孔 (100 μL培養(yǎng)基)。檢測白細(xì)胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 ( 100 μL培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10% 加入CCK-8溶液。 

④如果沒有450nm的濾光片，可以使用吸光度在430-490 nm 之間的濾光片，但是450nm檢測靈敏度高。 

⑤培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。