親和層析填料 鎳-瓊脂糖凝膠 H.P
貨號 ：S9320
規格 ：25mL

產品 簡介 ：
    苯甲脒類物質是絲氨酸蛋白酶的廣譜抑制劑，所以將這類物質偶聯到瓊脂糖凝膠上，可以從各種來源的樣品中一步純化胰蛋白酶、凝血酶、尿激酶、激肽釋放酶、前激肽釋放酶等絲氨酸蛋白酶。
    苯甲脒瓊脂糖凝膠由于應用新的活化方法所以流速高， 非特異吸附少， 而且填料粒度均勻，所以分離效果好，是純化絲氨酸蛋白酶類適合的填料。

親和填料 特征 ：

適用范圍 : 
    一步從各種樣品中純化絲氨酸蛋白酶類物質。

應用實例: 
   實驗名稱：苯甲脒瓊脂糖凝膠 FF分離尿激酶。

實驗步驟：
   （1）苯甲脒瓊脂糖凝膠 FF裝柱，1.6×20m，柱床體積為10ml
   （2）用緩沖液1平衡2-5個床體積，流速為2ml/min
   （3）取尿激酶粗品200mg溶解在20ml的緩沖液1中，用0.45µm的濾膜過濾，上樣，流速
為1ml/min
   （4）用緩沖液1再洗2-5個床體積，流速為2ml/min
   （5）后緩沖液2進行洗脫，流速為2ml/min，收集洗脫峰，用SDS-PAGE純化后的效果。
   （6）用純水洗5個柱床體積，然后分別用100mM，pH8.0Tris-HCl緩沖液含1M NaCl和100mM,pH4.0的醋酸緩沖液含1M NaCl交替洗滌3次，再用純水洗3個柱床體積，然后再用20%的乙醇流洗3個柱床體積，流速為2ml/min，柱子置于+4~8℃環境中保存。
   （7）色譜圖見圖1，SDS-PAGE結果見圖2。 緩沖液組成：
    緩沖液1：100mM pH7.4的PBS緩沖液；緩沖液2：100mM醋酸緩沖液，pH4.0。

也可以用這個填料特異去除各種融合蛋白酶切后的絲氨酸蛋白酶，例如凝血酶以及胰蛋
白酶類蛋白酶。例如去除凝血酶上樣緩沖液為：50mM pH7.4的PBS緩沖液含0.15M NaCl,洗脫緩沖液為：50mM pH7.4的PBS緩沖液含1M NaCl。

SDS-PAGE流程：
   （1）BSA法測量樣品蛋白濃度；
   （2）根據測定樣品的蛋白濃度，算出5-10µg/孔所需的體積；
   （3）向1.5ml EP管中加入含5-10µg蛋白的樣品溶液，若體積小于10µL，則加20mM PBS
pH7.4補足10µl；若體積大于10µl，則要加入1ml無水乙醇，－20℃下濃縮1h；
   （4）取濃縮樣品10000rpm離心15min，除去上清，37℃烘箱10min去除殘余的乙醇；
   （5）在樣品加入20mM PBS pH7.4和2×loading buffer各10µl，100℃下10min。取出后用冷卻30s，4000rpm離心1s；
   （6）點樣，電泳。

應用的注意事項 ：
   1  色譜柱裝填
   1、所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體好做脫氣處理。
   2、在柱子下端加入蒸餾水，以除去柱子中的空氣，關閉柱子出口，在柱內保留少量的
蒸餾水。
   3、將瓊脂糖凝膠連續倒入柱子時，要用玻璃棒的緊靠柱子內壁引流，以減少氣泡的產
生，讓填料先自然沉降。
   4、柱壓不超過0.3MPa，如果裝柱系統中無法測柱壓，則控制流速高于300cm/h，但是在
使用中一般只用大流速的75%。
   2  蛋白的結合
平衡緩沖液可以采用如下配方：100mM pH7.4的PBS緩沖液，0.1M NaCl，pH8.0。上樣完
畢后，繼續用平衡緩沖液洗柱子，直到基線平穩。
   3  蛋白的洗脫
  （1）洗脫可以采取特異性或者非特異性洗脫。
  （2）特異性洗脫可以用目標分子的競爭劑，對氨基苯甲脒的抑制劑。對非特異性洗脫
而言，可以選用以下幾種方法：
   a 改變離子強度，通常加入1M的NaCl，必要的話可以采用階段洗脫或線性梯度洗脫。
   b 改變pH，可采用階段洗脫洗脫或線性梯度洗脫來達到目的。
   c 降低洗脫緩沖液的極性。如可以在洗脫緩沖液中加入10%的二氧六環等。
   d 使用變性劑。如在洗脫緩沖液中加入尿素、鹽酸胍等。

再生、清洗: 
1  再生
   用純水洗5個柱床體積，然后分別用100mM，pH8.0Tris-HCl緩沖液含1M NaCl和
100mM,pH4.0的醋酸緩沖液含1M NaCl交替洗滌3次，再用水洗3個柱床體積，然后再用20%的乙醇流洗3個柱床體積，流速為2ml/min，柱子置于+4~8℃環境中。
   如果在色譜操作過程中用到了變性劑或者去污劑，也可以用上述方法洗柱子。
2  清洗
   在應用中，柱子上結合的一些物質如變性蛋白和脂質等不能通過再生過程去除，這種
情況下，可以用去污劑如0.1%Triton X-100在37℃洗柱子1min。之后立即用5個床體積的平衡液洗柱子。

保存: 
    在20%乙醇中，4℃下長期保存。

特別注意 ：
    上樣之前 ， 樣品必須去除色素 ， 否則色素會被吸附到填料上 ， 影響填料的正常使用

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