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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC3330-50T/48S
更新時間：2024-04-15
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：967
010-50973130
產品分類
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糖原合成酶（GCS）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC3330
規格：50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體45 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體15 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 液體40 μL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑四 | -20℃保存 | |
試劑五 | 粉劑×2支 | |
試劑六 | 液體115 μL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑七 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
試劑八 | 粉劑×2瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑四：提供一個5 mL試劑瓶，用前取1支加入3mL試劑一充分溶解，-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；
2、 試劑五：提供一個5 mL試劑瓶，用前取1支加入3mL試劑一充分溶解，-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；
3、 工作液的配制：臨用前將試劑三離心，取20 μL試劑三，加14 mL試劑一、3 mL試劑四、3mL試劑五，充分混合（約26T），現用現配，也可根據樣本量按比例配制；
4、 試劑八的配制：
（1） 臨用前取1瓶試劑八中加入6mL試劑二充分溶解，再將1支試劑七轉移到試劑八中混合溶解后待用，可-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；
（2） 用前先將試劑六離心，取55 μL試劑六加入5.74 mL上述（1）中溶液，充分混合（約28T），現用現配，也可根據樣本量按比例配制。
產品說明：
糖原合成酶（Glycogen synthase , GCS）將UDPG的糖基加到原有糖原或是糖原蛋白的非還原端，以α-1,4糖苷鍵連接。GCS是動物機體糖原合成過程的限速酶，同時也是胰島素作用的主要靶酶，在糖代謝及維持血糖相對穩定的過程中有著重要作用。
GCS催化UDPG和葡萄糖殘基生成糖原和UDP，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進一步依次催化NADH生成NAD+，在340 nm下測定NADH的下降速率，即可反映GCS活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、低溫臺式離心機、水浴鍋、1mL石英比色皿、可調式移液槍、超聲破碎儀、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后，8000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。
細菌或細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細胞數量（104個）:提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細菌或細胞（功率200w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
血清等液體：直接檢測。（若溶液渾濁則離心后取上清進行測定）
二、測定步驟
1、 紫外分光光度計預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。
2、 臨用前將工作液與試劑八置于37℃水浴鍋中預熱5min（工作液用多少預熱多少）。
3、 操作表：在1mL石英比色皿中分別加入下列試劑：
試劑名稱（µL） | 空白管 | 測定管 |
樣本 | - | 50 |
蒸餾水 | 50 | - |
工作液 | 750 | 750 |
試劑八 | 200 | 200 |
加入樣本即開始計時，充分混勻后于340nm處測定10s時的吸光值A1和1min 10s時的吸光值A2，計算ΔA測定管=A1測定-A2測定，ΔA空白管=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管（空白管只需做1-2次）。 | ||
三、GCS酶活計算
1. 按蛋白濃度計算
酶活定義：每毫克蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GCS酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷（V樣×Cpr）÷T= 3215.4×ΔA÷Cpr
2. 按樣本質量計算
酶活定義：每克樣本每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GCS酶活（U/g 質量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷（V樣×W÷V樣總）÷T =3215.4×ΔA÷W
3. 按細菌或細胞數量計算
酶活定義：每104個細胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GCS酶活（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷（V樣÷V樣總×細胞數量（萬個））÷T
= 3215.4×ΔA÷細胞數量（萬個）
4. 按液體體積計算
酶活定義：每毫升液體每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GCS酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷V樣÷T =3215.4×ΔA
ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；109：單位換算系數，1mol=109nmol；
V反總：反應體系總體積，1×10-3L；V樣：反應體系中樣本體積，0.05mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間：1min。
注意事項：
1、 樣本提取上清液置于冰上待測，提取樣本建議當天測完。
2、 若ΔA大于0.2，建議將樣本用提取液稀釋適當倍數后測定，以提高檢測靈敏度，并在計算公式中乘以相應的稀釋倍數。
實驗實例：
1、 取0.1g小鼠心臟加入1mL提取液進行樣本處理，取上清后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管=A1測定-A2測定=1.177-1.119=0.058，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.944-0.939=0.005，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.058-0.005=0.053，按照樣本質量計算酶活得：
GCS酶活（U/g 質量）=3215.4×ΔA÷W=1704.162 U/g 質量。
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