線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ/琥珀酸-輔酶Q還原酶活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC3235
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前加入0.1mL丙 酮，丙 酮易揮發(fā)，使用完畢后注意封口，-20℃可保存2個月；

2. 試劑二工作液：臨用前根據(jù)樣本量將試劑二：丙 酮=10μL:1mL（約100T）混合備用，現(xiàn)用現(xiàn)配；

3. 試劑三：臨用前取1支加入1mL丙 酮，充分溶解，用不完的試劑-20℃分裝可保存4周（1瓶粉劑溶解后可做100T，為延長試劑盒使用時間，此產(chǎn)品多給1支粉劑），注意封口；

4. 工作液的配制：臨用前根據(jù)樣本量將丙 酮：試劑二工作液：試劑三=0.25mL：0.5mL：0.25mL（1mL，約50T）混合備用，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：
線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ又稱琥珀酸-輔酶Q還原酶，廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同時輔基FAD還原為FADH₂，后者進一步還原氧化型輔酶Q生成還原型輔酶Q，是呼吸電子傳遞鏈的支路。
復(fù)合體Ⅱ的催化產(chǎn)物還原型輔酶Q可進一步還原2,6-二氯吲哚酚，2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰，通過檢測2,6-二氯吲哚酚的減少速率來計算該酶活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、細胞超聲破碎儀、丙 酮、冰和蒸餾水。

操作步驟：具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件

注意事項：

1. 為保證實驗結(jié)果的準確性，需先取1-2個樣做預(yù)實驗，如果測定的吸光值大于1.2（微量比色皿）/0.8（96孔板），可用蒸餾水稀釋上清液后再測定。計算結(jié)果時注意乘以稀釋倍數(shù)。若ΔA大于0.6（微量比色皿）/0.4（96孔板），需將樣本稀釋適當(dāng)倍數(shù)（計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）；若ΔA偏小，則可以通過增加加入的樣本體積來提高靈敏度。

2. 樣本蛋白濃度需自行測定。由于提取液一中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測定樣本蛋白濃度時需要減去重懸試劑（提取液一+提取液二）本身的蛋白含量（約0.5mg/mL）。

3. 推薦使用樣本蛋白濃度計算酶活，若用樣本質(zhì)量計算，則需加測胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。

4. 附：使用樣本重量計算公式：（樣本檢測數(shù)為50T/24S） 

A、上清中復(fù)合體Ⅱ活性的計算：
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活性（U/g 質(zhì)量）= [ΔA1×V反總÷（ε×d）×10⁹] ÷ (W÷V提取×V樣) ÷ T =190.5×ΔA1÷W
B、沉淀中復(fù)合體Ⅱ活性的計算:
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活性（U/g 質(zhì)量）= [ΔA2×V反總÷（ε×d）×10⁹] ÷ (W÷V重懸×V樣) ÷ T=76.2×ΔA2÷W
C、樣本復(fù)合體Ⅱ總活性的計算：
樣本復(fù)合體Ⅱ總活性即為上清中復(fù)合體Ⅱ活性與沉淀中復(fù)合體Ⅱ活性之和。
復(fù)合體Ⅱ總活性（U/g 質(zhì)量）=190.5×ΔA1÷W +76.2×ΔA2÷W
ΔA1：上清測定值；ΔA2：沉淀測定值；V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V提取：樣本勻漿加入提取液一的體積，1mL；V重懸：沉淀重懸加入提取液一和提取液二的總體積，0.4mL；V樣：加入樣本體積，0.01mL；T：反應(yīng)時間，5min；W：樣本重量，g；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。
D、以96孔板計算：
將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm進行計算即可。

1. 附：使用細胞數(shù)量計算公式：（樣本檢測數(shù)為50T/24S） 

A、上清中復(fù)合體Ⅱ活性的計算：
單位的定義：每10⁶個細胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活性（U/10⁶ cell）= [ΔA1×V反總÷（ε×d）×10⁹] ÷ (N÷V提取×V樣) ÷ T =190.5×ΔA1÷N
B、沉淀中復(fù)合體Ⅱ活性的計算:
單位的定義：每10⁶個細胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活性（U/10⁶ cell）= [ΔA2×V反總÷（ε×d）×10⁹] ÷ (N÷V重懸×V樣) ÷ T=76.2×ΔA2÷N
C、樣本復(fù)合體Ⅱ總活性的計算：
樣本復(fù)合體Ⅱ總活性即為上清中復(fù)合體Ⅱ活性與沉淀中復(fù)合體Ⅱ活性之和。
復(fù)合體Ⅱ總活性（U/10⁶ cell）=190.5×ΔA1÷N +76.2×ΔA2÷N
ΔA1：上清測定值；ΔA2：沉淀測定值；V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V提取：樣本勻漿加入提取液一的體積，1mL；V重懸：沉淀重懸加入提取液一和提取液二的總體積，0.4mL；V樣：加入樣本體積，0.01mL；T：反應(yīng)時間，5min；N：細胞數(shù)量，以10⁶ 計；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。
D、以96孔板計算：
將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm進行計算即可。
相關(guān)發(fā)表文獻：

1. Qiuli OuYang, Nengguo Tao, Miaoling Zhang. A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum. February 2018;(IF4.259)

2. Wang M, Zhang Y, Xu M, et al. Roles of TRPA1 and TRPV1 in cigarette smoke-induced airway epithelial cell injury model[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2019, 134: 229-238.

3. Bao Z, Xu X, Chao H, et al. ERK/Nrf2/HO-1 pathway-mediated mitophagy alleviates traumatic brain injury- induced intestinal mucosa damage and epithelial barrier dysfunction[J]. 2017.

參考文獻：

1. Mühling J, Tiefenbach M, López-Barneo J, et al. Mitochondrial complex II participates in normoxic and hypoxic regulation of α-keto acids in the murine heart[J]. Journal of molecular and cellular cardiology, 2010, 49(6): 950-961.

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