北京索萊寶科技有限公司
專注于生物學試劑及試劑盒領域
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產品型號：BC0980
更新時間：2024-04-15
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：2037
010-50973130
產品分類
乙酰輔*A含量檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC0980
規格：25T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶配內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
| 試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
| 提取液一 | 液體30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 提取液二 | 液體300 μL×1支 | -20℃保存 |
| 試劑一 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
| 試劑二 | 液體10 μL×1支 | 2-8℃保存 |
| 試劑三A | 液體25 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 試劑三B | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
| 試劑四 | 液體5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
試劑一：臨用前加入325μL試劑四，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融；
試劑二：臨用前取1支先將液體甩離至管底，然后加入250μL試劑四，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融；
試劑三：臨用取試劑三B加入24mL試劑三A，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融；
工作液：臨用前將試劑一、二和三按照1:1:90的比例混合，根據樣本量現配現用。
產品說明：
乙酰輔*A廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，是生物體能源物質代謝過程中產生的一種重要的中間代謝產物，在體內能源物質代謝中是一個樞紐性的物質。糖、脂肪、蛋白質三大營養物質通過乙酰輔*A匯聚成一條共同的代謝通路-三羧酸循環和氧化磷酸化，經過這條通路氧化生成二氧化碳和水，釋放能量用于ATP合成。此外，乙酰輔*A是合成脂肪酸、酮體、膽*醇及其衍生物等生理活性物質的前體物質。
蘋果酸脫氫酶可催化蘋果酸和NAD+生成草酰乙酸和NADH。檸檬酸合酶可催化乙酰輔*A和草酰乙酸生成檸檬酸和輔*A。利用蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶的偶聯反應，乙酰輔*A含量和NADH的生成速率成正比，340nm下吸光值的上升速率反應了乙酰輔*A含量的高低。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、天平、水浴鍋/恒溫培養箱、臺式低溫離心機、1mL石英比色皿、可調式移液槍、研缽/勻漿器、冰、蒸餾水。
操作步驟：
樣本處理
組織：建議稱取約0.1g樣本，加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二進行冰浴勻漿。于4℃，8000g離心10min，取上清，置于冰上待測。
細胞或細菌：建議取500萬細胞或細菌加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二，冰浴超聲波破碎細胞或細菌（功率200w，超聲3秒，間隔10秒，重復30次），于4℃，8000g離心10min，取上清，置于冰上待測。
血清（漿）或其他液體：直接檢測，若液體有渾濁則離心后測定。
二、測定步驟
紫外分光光度計預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。
將工作液37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）預熱10min。
取200μL樣本和820μL工作液至1mL石英比色皿，混勻，立即記錄340nm處20s的吸光值A1和80s時的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。
乙酰輔*A含量計算
按樣本質量計算
乙酰輔*A含量（nmol/g 質量）＝(ΔA÷ε÷d)×V反×109÷V樣×V提÷W×F=819.9×ΔA÷W×F
按照細胞數量計算
乙酰輔*A含量（nmol/104 cell）＝(ΔA÷ε÷d)×V反×109÷V樣×V提÷500×F=1.640×ΔA×F
按液體體積計算
乙酰輔*A含量（nmol/mL）＝(ΔA÷ε÷d)×V反×109÷V樣×F=819.9×ΔA×F
ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；109：單位換算系數，1mol=109nmol；V反：反應總體積，1.02×10-3L；V樣：加入樣本上清體積，0.2mL；V提：加入提取液一和提取液二的總體積，1mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌數量，500萬；F：稀釋倍數。
實驗實例：
稱取0.1g鼠腎加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二進行勻漿研磨，離心后取上清，按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得計算ΔA= A2-A1=0.667-0.745=0.078，按樣本質量計算酶活得：乙酰輔*A含量（nmol/g 質量）＝819.9×0.078÷0.1=639.5 nmol/g 質量。
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