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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC5760-50T/24S
更新時間：2024-04-23
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1181
010-50973130
產品分類
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蘋果酸合酶（MS）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號：BC5760
規格：50T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體40 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體1.5 mL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑四 | 液體3 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑五 | 液體15 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑六 | 液體3 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑三：臨用前加入1.5mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融。
產品說明：
蘋果酸合酶（Malate Synthase，EC2.3.3.9）是屬于轉移酶中酰基轉移酶的一類，主要存在于植物和微生物中。是乙醛酸循環的關鍵酶之一，在MS催化下乙醛酸與乙酰輔*A反應生成蘋果酸。MS催化乙酰CoA和乙醛酸產生蘋果酸，同時生成輔*A，輔*A使無色的DTNB轉變成黃色的TNB，在412nm處有特征吸收峰，據此可以計算MS活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、1mL玻璃比色皿、天平、低溫離心機、水浴鍋、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1. 組織：按照組織質量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿。12000g，4℃離心 10min，取上清置于冰上待測。
2. 細菌/細胞：按照細菌/細胞數量（106個）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬細菌/細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎（功率200W，超聲3秒，間隔7秒，總時間5min）；然后12000 g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。
3. 培養上清等液體：直接檢測，若有渾濁可以離心后取上清測定。
二、測定步驟
1、 可見分光光度計預熱30min以上，調節波長至412nm，蒸餾水調零。
2、 試劑一25℃預熱15min。
3、 操作表：（在1.5mL EP管中加入下列試劑）
（1）酶促反應
試劑名稱（μL） | 對照管 | 測定管 |
試劑一 | 700 | 600 |
試劑二 | - | 50 |
試劑三 | - | 50 |
樣本 | 250 | 250 |
充分混勻，25℃反應20min | ||
試劑四 | 50 | 50 |
充分混勻，4℃ 12000g離心5min，取上清于1.5mL EP 管中。 | ||
（2）顯色反應
試劑名稱（μL） | 對照管 | 測定管 |
上清液 | 700 | 700 |
試劑五 | 250 | 250 |
試劑六 | 50 | 50 |
充分混勻靜置5min，測定412nm下的吸光度，分別記為A對照、A測定。計算ΔA=A測定-A對照。每個測定管需設一個對照管。 | ||
三、蘋果酸合酶（MS）計算公式
1. 按樣本蛋白濃度計算：
酶活定義：25℃下每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘催化產生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。
MS活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V顯色÷V上清液×V酶促÷（Cpr×V樣）÷T×F =21×ΔA÷Cpr×F
2. 按樣本質量計算：
酶活定義：25℃下每g組織在反應體系中每分鐘催化產生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。
MS活性（U/g 質量）=ΔA÷（ε×d）×V顯色÷V上清液×V酶促÷（W÷V提取×V樣）÷T×F =21×ΔA÷W×F
3. 按細菌/細胞計算：
酶活定義：25℃下每106個細菌/細胞在反應體系中每分鐘催化產生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。
MS活性（U/106 cell）=ΔA÷（ε×d）×V顯色÷V上清液×V酶促÷（N÷V提取×V樣）÷T×F =21×ΔA÷N×F
4. 按液體體積計算：
酶活定義：25℃下每mL液體在反應體系中每分鐘催化產生1nmol TNB定義為一個酶活力單位。
MS活性（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V顯色÷V上清液×V酶促÷V樣÷T×F =21×ΔA÷N×F
ε：TNB摩爾消光系數，13.6×10-3mL/(nmol·cm)；d：比色皿光徑，1cm；V顯色：顯色反應總體積，1mL；V上清液：顯色反應中上清液體積，0.7mL；V酶促：酶促反應總體積，1mL；V樣：反應體系中加入的樣本體積，0.25mL；V提取：加入提取液的體積，1mL；T：反應時間，20min；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；N：細菌或細胞總數，以106計；F：稀釋倍數。
注意事項：
1. 測定過程中樣本和所有試劑在冰上放置，以免變性和失活。
2. 最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結果的準確性。
3. 若樣本ΔA<0.01，可適當增大樣本量重新提取或增大加樣表樣本體積（可同時降低試劑一體積保證總體積不變）后測定；若樣本ΔA>1.0或A測定>1.5，可用蒸餾水稀釋上清液后測定，注意同步修改計算公式中的稀釋倍數。
實驗實例：
1、 取0.1141g霉菌加入1mL提取液進行冰浴勻漿，取上清后按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得ΔA=A測定-A對照=0.338-0.270=0.068，按樣本質量計算MS活性得：
MS活性（U/g 質量）=21×ΔA÷W×F =12.515 U/g 質量。
2、 取0.1169g萌芽的綠豆加入1mL提取液進行冰浴勻漿，取上清后用蒸餾水稀釋2倍后按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得ΔA=A測定-A對照=0.634-0.398=0.236，按樣本質量計算MS活性得：
MS活性（U/g 質量）=21×ΔA÷W×F =84.790. U/g 質量。
3、 取0.1102g芒果加入1mL提取液進行冰浴勻漿，取上清后按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得ΔA=A測定-A對照=0.507-0.201=0.306，按樣本質量計算MS活性得：
MS活性（U/g 質量）=21×ΔA÷W×F =58.312 U/g 質量。
參考文獻：
[1] Roucourt B, Minnebo N, Augustijns P, Hertveldt K, Volckaert G, Lavigne R. Biochemical characterization of malate synthase G of P. aeruginosa. BMC Biochem. 2009 Jun 24;10:20.
[2] Miernyk JA, Trelease RN, Choinski JS. Malate synthase activity in cotton and other ungerminated oilseeds: a survey. Plant Physiol. 1979 Jun;63(6):1068-71.
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