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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC4960-50T/24S
更新時間：2024-04-17
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1003
010-50973130
產品分類
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硝酸還原酶（NR）活性檢測試劑盒（Griess顯色法）說明書
可見分光光度法
貨號：BC4960
規格：50T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
誘導劑儲備液 | 液體50 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液 | 液體30mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體12 mL×1瓶 | -20℃保存 |
試劑二 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體15 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體15 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 液體1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 誘導液：將誘導劑儲備液用蒸餾水10倍稀釋后使用，即取10 mL誘導劑儲備液加90 mL蒸餾水，充分混勻。現配現用。
2、 試劑二：加入1mL蒸餾水，-20℃分裝保存，可以-20℃保存2周。臨用前用蒸餾水將試劑二稀釋50倍，備用，即取10 μL試劑二加入490 μL蒸餾水混勻。
3、 標準品：10 μmol/mL亞硝*標準溶液。臨用前將用蒸餾水標準溶液稀釋100倍得到0.1 μmol/mL的亞硝*標準液，備用。
產品說明：
NR（EC 1.7.1.3）廣泛存在于植物中，是植物硝態氮轉化為氨態氮的關鍵酶，也是誘導酶，對作物的產量和品質有影響。NR催化硝酸鹽還原為亞*鹽，NO3ˉ +NADH+H＋→NO2ˉ+NAD＋+H2O。在酸性條件下，產生的NO2ˉ能夠參與重氮化反應生成紫紅色化合物，這種紫紅色化合物在540 nm處有吸收峰，540 nm下吸光值的變化即可表示酶活。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、水浴鍋/培養箱、臺式離心機、1 mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、組織前處理：
（1） 取適量誘導液于燒杯中，將新鮮標本洗凈，濾紙吸干，放入誘導液中（淹沒即可），避光浸泡2 h，取出樣本，濾紙吸干后，-20℃冷凍30 min，取出樣本，濾紙吸干。（根據需要進行誘導處理，一般不需要誘導處理，預實驗結果沒有活性則需要進行誘導處理）
（2） 按照組織質量(g)：提取液體積(mL)為1:5~10的比例(稱取約0.1 g樣本，加入1 mL提取液)，冰浴研磨，8000g，4℃離心10 min，取上清置冰上待測。
2、細胞或細菌的前處理：
先收集細胞或細菌樣本到離心管內，棄上清，按照每500萬細胞或細菌加入1mL提取液，超聲波破碎細菌或細胞（功率200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）。8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
二、測定步驟
1、 可見分光光度計預熱30 min以上，調節波長至540 nm，蒸餾水調零。
2、 樣本測定：
試劑名稱（μL） | 測定管 | 對照管 | 標準管 | 空白管 |
樣本 | 100 | 100 | - | - |
0.1 μmol/mL標準溶液 | - | - | 100 | - |
蒸餾水 | - | 375 | - | 475 |
試劑一 | 375 | - | 375 | - |
試劑二 | 125 | 125 | 125 | 125 |
混勻，37℃(哺乳動物)或25℃(其他物種)反應30 min | ||||
試劑三 | 250 | 250 | 250 | 250 |
試劑四 | 250 | 250 | 250 | 250 |
混勻，室溫顯色20 min后測定540nm下的吸光度，分別記為A測定、A對照、A標準、A空白。 | ||||
三、NR活性計算
（1）按樣本蛋白濃度計算：
酶活定義：每小時每mg組織蛋白催化產生1 μmol NO2-的量為1個NR活力單位。
NR活力（U/mg prot）= C標準×（A測定-A對照）÷（A標準-A空白）×V樣本÷（V樣本×Cpr）÷T×F
= 0.2×（A測定-A對照）÷（A標準-A空白）÷Cpr×F
（2）按樣本質量計算：
酶活定義：每小時每g組織催化產生1 μmol NO2-的量為1個NR活力單位。
NR活力（U/g 質量）=C標準×（A測定-A對照）÷（A標準-A空白）×V樣本÷（W×V樣本÷V提取）÷T×F
= 0.2×（A測定-A對照）÷（A標準-A空白）÷W×F
（3）按細胞數量計算：
酶活定義：每小時每1萬個細胞或細菌催化產生1 μmol NO2-的量為1個NR活力單位。
NR活力（U/104 cell）
=C標準×（A測定-A對照）÷（A標準-A空白）×V樣本÷（細胞或細菌數量×V樣本÷V提取）÷T×F
=0.2×（A測定-A對照）÷（A標準-A空白）÷細胞或細菌數量×F
C標準：亞硝 *標準溶液濃度，0.1 μmol/mL；V提取：加入提取液體積，1 mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，0.5 h；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.1 mL；細胞或細菌數量：以萬計；F：樣本稀釋倍數。
注意事項：
1. 吸光度大于0.8時，建議用提取液稀釋樣本，注意計算公式中參與計算的稀釋倍數要相應改變。
2. 嚴格按照樣本測定表格列出順序加入試劑進行實驗。
實驗實例：
1. 取0.1 g綠蘿葉片加入1 mL提取液進行勻漿研磨，離心取上清按照測定步驟操作，測得A測定=0.072、A對照=0.051、A標準=0.363、A空白=0.005，按樣本質量計算酶活得：
NR活力（U/g 質量）= 0.2×（A測定-A對照）÷（A標準-A空白）÷W= 0.117 U/g 質量。
2. 取0.1 g洋桔梗葉片加入1 mL提取液進行勻漿研磨，離心取上清按照測定步驟操作，測得A測定=0.063、A對照=0.032、A標準=0.363、A空白=0.005，按樣本質量計算酶活得：
NR活力（U/g 質量）= 0.2×（A測定-A對照）÷（A標準-A空白）÷W= 0.173 U/g 質量。
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