北京索萊寶科技有限公司
專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC2350
更新時間：2024-07-09
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1733
010-50973130
產品分類
3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
貨號: BC2210
規格: 25T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
| 試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
| 提取液 | 液體30 mL×1瓶 | 4℃保存 |
| 試劑一 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
| 試劑二 | 液體25 mL×1瓶 | 4℃保存 |
| 試劑三 | 液體15 µL×1瓶 | 4℃保存 |
溶液的配制：
試劑三：液體置于試劑瓶內EP管中。根據用量按照試劑三:蒸餾水為3:100的體積比例充分混勻，現用現配。
工作液的配制：將試劑二全部倒入試劑一瓶中，充分溶解，根據需要取一定的量37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）預熱10min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
產品說明：
GAPDH（EC1.2.1.12）催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途徑的關鍵酶，與糖異生途徑、體內血糖濃度的維持和糖尿病的發生密切相關，在機體糖、脂、蛋白代謝紊亂疾病中發揮重要作用。
磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3-二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3-二磷酸甘油酸和NADH生成3-磷酸甘油醛、無機磷和NAD+，340nm處測定NADH的減少量可反映GAPDH活性的高低。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、1mL石英比色皿、可調式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心20min，取上清，置冰上待測。
細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
血清（漿）：直接檢測。
二、測定步驟
分光光度計預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。
操作表：在1mL石英比色皿中分別加入下列試劑：
| 試劑名稱 | 空白管 | 測定管 |
| 樣本（µL） | 30 | |
| 蒸餾水（µL） | 30 | |
| 試劑三（µL） | 20 | 20 |
| 工作液（µL） | 950 | 950 |
| 在1mL石英比色皿中分別加入上述試劑，充分混勻后于340nm處測定10s時的吸光值A1，迅速置于37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）水浴5min，拿出迅速擦干測定5min10s時的吸光值A2，計算ΔA測定管= A1測定-A2測定，ΔA空白管=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管。（空白管只需做1-2次） | ||
三、GAPDH酶活計算
1、按樣本蛋白濃度計算
酶活定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GAPDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=1072×ΔA÷Cpr
2、按樣本質量計算
酶活定義：每g組織每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GAPDH酶活（U/g 質量）=ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T=1072×ΔA÷W
3、按照細菌或細胞數量計算
酶活定義：每104個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GAPDH酶活（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷（500×V樣÷V樣總）÷T=2.14×ΔA
4、按照血清（漿）體積計算
酶活定義：每mL樣本每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GAPDH酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷V樣÷T= 1072×ΔA
ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103L/mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體系總體積，0.001L；V樣：反應體系中樣本體積，0.03mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測定；W：樣本質量，g；T：反應時間：5min；500：細菌或細胞總數，500萬；109：單位換算系數，1mol=109nmol。
注意事項：
當A1小于0.8或ΔA大于0.7時，建議將樣本稀釋后再進行測定。
空白管為檢測各試劑組分質量的檢測孔，正常情況下，變化不超過0.01。
實驗實例：
取0.1g兔腎臟加入1mL提取液，進行冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心20min，取上清置冰上，之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管=A1測定-A2測定=0.815-0.158=0.657，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.865-0.864=0.001，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.656，按樣本質量計算酶活得：GAPDH酶活（U/g質量）=1072×ΔA÷W=7032.32 U/g質量。
取0.1g三葉草加入1mL提取液，進行冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心20min，取上清置冰上，之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管=A1測定-A2測定=1.026-1.017=0.009，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.865-0.864=0.001，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.008，按樣本質量計算酶活得：GAPDH酶活（U/g質量）= 1072×ΔA÷W=85.76 U/g質量。
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