北京索萊寶科技有限公司
專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC2670-50T/24S
更新時間：2024-07-09
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1271
010-50973130
產品分類
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糖化酶活性檢測試劑
盒說明書
可見分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC2670
規格：50T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
| 試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
| 提取液 | 液體110 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 試劑一 | 粉劑×2瓶 | 2-8℃保存 |
| 試劑二 | 液體35 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 標準品 | 粉劑×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
試劑一：臨用前取1瓶加入20 mL提取液，充分混勻后沸水浴直至溶解（約10min），2-8℃保存4周；
標準品：10 mg無水*萄糖。臨用前加1 mL提取液溶解為10 mg/mL的葡萄糖標準品備用，2-8℃保存2周；
產品說明：
糖化酶，即葡萄糖淀*酶（EC3.2.1.3），又稱γ-淀*酶。糖化酶是由一系列微生物分泌的，具有外切酶活性的胞外酶，主要作用是從淀粉、糊精、糖原等碳鏈上的非還原性末端依次水解α-1,4糖苷鍵，切下一個個葡萄糖單元，對于支鏈淀粉，當遇到分支點時，它也可以水解α-1,6 糖苷鍵由此將支鏈淀粉全部水解成葡萄糖。多應用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有機酸，甘油，淀粉糖等工業中，是我國重要的工業酶制劑之一。
糖化酶將可溶性淀粉生成葡萄糖，堿性條件下，葡萄糖與3,5-二硝基水楊酸共熱后生成紅棕色化合物，在540nm處有最大光吸收，在一定范圍內葡萄糖的量與反應液顏色深淺成正比，以此測定糖化酶的活力。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
天平、低溫離心機、可見分光光度計、1 mL玻璃比色皿、恒溫水浴鍋、研缽/勻漿器/超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
按照組織質量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測。
細胞：按照細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），
冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測。
培養液或其它液體：直接檢測。（若有渾濁則離心后進行測定）
二、測定步驟
分光光度計預熱30min以上，調節波長至540nm，蒸餾水調零。
標準品準備：將標準品用蒸餾水稀釋至1.5、1.0、0.8、0.4、0.2、0.1mg/mL。
| 序號 | 稀釋前濃度（mg/mL） | 標準液體積（µL） | 蒸餾水體積（µL） | 稀釋后濃度（mg/mL） |
| 1 | 10 | 200 | 800 | 2.0 |
| 2 | 2.0 | 150 | 50 | 1.5 |
| 3 | 2.0 | 300 | 300 | 1.0 |
| 4 | 1.0 | 320 | 80 | 0.8 |
| 5 | 0.8 | 200 | 200 | 0.4 |
| 6 | 0.4 | 200 | 200 | 0.2 |
| 7 | 0.2 | 200 | 200 | 0.1 |
實驗中每個標準管需50µL標準溶液。
吸取50μL樣本于1.5mLEP管中沸水浴5min作為對照管的滅活樣本。
加樣表：
三、糖化酶活性計算
1. 標準曲線的繪制：
根據標準管的濃度（x，mg/mL）和吸光度ΔA標（y，ΔA標），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA測（y，ΔA測）帶入公式計算樣本濃度（x，mg/mL）。
2. 酶活性計算：
（1）按照蛋白濃度計算：
酶活性定義：在40℃每毫克蛋白每小時產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。
糖化酶活性（U/mg prot）=x×V樣總÷（V樣總×Cpr）÷T=3x÷Cpr
（2）按照樣本質量計算
酶活性定義：在40℃每克組織每小時產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。
糖化酶活性（U/g 質量）= x×V樣總÷W÷T=3x÷W
（3）按照液體體積計算
酶活性定義：在40℃每毫升液體每小時產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。
糖化酶活性（U/mL）= x×V樣÷V樣÷T=3x
（4）按照細胞數量計算
酶活性定義：在40℃每104個細胞每小時產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。
糖化酶活性（U/104 cell）= x×V樣總÷500÷T=0.006x
V樣：反應體系中加入的樣本體積，50μL=0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，需自行測定；W：樣本質量，g；T：反應時間，20min=0.333h；500：細胞數量，500萬。
注意事項：
測定之前進行預實驗，若吸光值較高，請將樣本用提取液進行適當的稀釋再測定，并在計算公式中乘以稀釋倍數。
實驗實例：
取0.1g玉蘭葉片加入1mL提取液冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上，之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測=A測定管-A對照管=0.738-0.584=0.154，帶入標準曲線y=0.7372x+0.0175，計算x=0.18516，按樣本質量計算酶活得：
糖化酶活性（U/g 質量）=3x÷W=5.55 U/g 質量。
取0.1g肝臟加入1mL提取液冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上，之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測=A測定管-A對照管=1.420-1.282=0.138，帶入標準曲線y=0.7372x+0.0175，計算x=0.163，按樣本質量計算酶活得：
糖化酶活性（U/g 質量）=3x÷W=4.89 U/g 質量。
取兔血清按照測定步驟操作，測得計算ΔA測=A測定管-A對照管=1.447-0.753=0.694，帶入標準曲線y=0.7372x+0.0175，計算x=0.918，按照液體體積計算：
糖化酶活性（U/mL）=3x=2.754 U/mL。
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