人腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒注意事項：
1.試劑盒應在有效期內使用，請不要使用過期的試劑。
2.試劑盒未使用時應保存在 2-8℃冰箱，已復溶但未用完的標準品，請丟棄。
3.試劑盒使用前請在室溫恢復 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4.在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測，且加入試劑的順序應保持*。
5.為避免交叉污染，請在試驗中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。.
6.濃縮生物素化抗體和濃縮酶結合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹打幾次。
7.除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分。
8.為保證結果準確，每次檢測均需做標準曲線。


安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物實驗室安全防護有關管理規定執行。
 

自備實驗器材（不提供，可代購）
1． 酶標儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水，去離子水，量筒等
6． 稀釋用聚丙烯試管

人腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒樣本收集及儲存：
1. 細胞培養上清：
將細胞培養基移無菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復凍融。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據標本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。

※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高于標準品的值，請將樣品做適當倍數稀釋后檢測，建議正式實驗前做預實驗以確定稀釋倍數。 

試劑準備：
1. 試劑回溫：先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現結晶，請放入37℃溫浴直到結晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3. 標準品梯度稀釋：加入標準品/樣本稀釋液（SR1）1ml凍干標準品中，靜置15分鐘待其*溶解后輕輕混勻(濃度為2000pg/ml)，然后在其余七管中各加入500?L標準品/樣本稀釋液（SR1），按照以下濃度進行2倍稀釋：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62 pg/ml進行稀釋。500pg/ml為標準曲線點濃度，標準品/樣本稀釋液（SR1）作為標準曲線的零點（0pg/ml）。復溶過的標準品原液（2000pg/ml）未用完的應廢棄或根據需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。

4. 生物素化抗體工作液：預先計算好試驗所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應用工作液（稀釋前充分混勻），請在30分鐘內加入到反應孔中。


5. 酶結合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結合物稀釋成1倍應用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內使用。


6. 洗滌方法：
? 自動洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/孔,注與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次。
? 手工洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止 30 秒后甩凈酶標板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次。

人腫瘤壞死因子αELISA試劑盒結果判斷：
1.用酶標儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進行雙波長檢測，請用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。
2.計算標準品、樣品的平均 OD 值：每個標準品和標本的 OD 值應減去零孔的 OD 值
3.以標準品濃度為橫坐標，吸光度OD值為縱坐標，用軟件繪制標準曲線，樣品中TNF-α含量可通過對應OD值由標準曲線換算出相應的濃度。
4.若標本 OD 值高于標準曲線上限，應做適當稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數。

1. 數據及標準曲線

2. 靈敏度：
低可檢測人 TNF-α濃度達 8pg/ml，
20 個零標準品濃度 OD 的平均值加上兩個標準差，計算相應的可檢測濃度。

3. 特異性：
不與人 TNF-β，GM-CSF，s TNF RI，s TNF RII 反應，小鼠 TNF-α，s TNF RI 等反應。

4. 重復性：
板內，板間變異系數<10%。

5. 回收率：
在選取的健康人血漿、細胞培養上清中加入 3 個不同濃度水平的人 TNF-α，計算回收率。

6. 人腫瘤壞死因子α酶聯免疫試劑盒線性稀釋：
分別在選取的 4 份健康人血漿和細胞培養上清中加入高濃度人 TNF-α，在標準曲線動力學范圍內進行稀釋，評估線性。

常見問題及解決方法：